Выделение и искусственный синтез белков

Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также для изучения их химического состава и строения непременным условием является получение белков из природных источников в химически индивидуальном гомогенном состоянии. Последовательность операций по выделению белков обычно сводится к

• Гомогенизации биологического материала (измельчению) [показать]

  Гомогенизация биологического материала

  Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани животных, микроорганизмы, растения) исследуемый материал тщательно измельчают до однородного гомогенного состояния, т. е. подвергают дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной структуры. Эту процедуру, называемую гомогенизацией, проводят при помощи ножевых гомогенизаторов типа Уорринга или пестикового гомогенизатора Поттера-Эльвегейма. Для выделения ряда белков из плотных животных и растительных объектов часто используют валковые или шаровые мельницы (рис. 1.1). Успешно применяется также метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, в основе "разрушающего" действия которого лежит разрывание клеточной оболочки, вызванное кристаллами льда. Для дезинтеграции тканей используют ультразвук, пресс-методы (пропускание замороженного биоматериала через мельчайшие отверстия стального пресса под высоким давлением) и метод "азотной бомбы", при котором клетки (в частности, микробные) сначала насыщают азотом под высоким давлением, затем резко сбрасывают давление, и выделяющийся газообразный азот как бы "взрывает" клетки.

• Экстракция белков (извлечению) [показать]

  Экстракция белков

  Современные методы измельчения тканей обычно сочетаются с одновременной экстракцией белков из гомогенатов тканей. Большинство белков тканей хорошо растворимы в 8-10% растворах солей. При экстракции белков широко применяются различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты - вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами.

  Из органических соединений, помимо давно применяемых водных растворов глицерина, широко используются (особенно для целей солюбилизации) слабые растворы сахарозы.

  На растворимость белков при экстракции большое влияние оказывает рН среды, поэтому в белковой химии применяются фосфатные, цитратные, боратные буферные смеси, со значениями рН от кислых до слабощелочных, которые способствуют как растворению, так и стабилизации белков. Особенно широкое распространение получили трис-буферные системы, представляющие собой смеси 0,2 М раствора трис-(оксиметил)-аминометана (НОСН2)3СNН2 (сокращенно обозначаемого "трис") с 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты в разных соотношениях.

  Для выделения белков сыворотки крови используются способы их осаждения этанолом (метод Кона), ацетоном, бутанолом и их комбинации. Почти все органические растворители разрывают белково-липидные связи, способствуя лучшей экстракции белков.

  С целью получения белков в чистом, гомогенном состоянии из биологического материала применяют различные детергенты, способствующие расщеплению белково-липидных комплексов и разрыву белково-белковых связей. В частности, для освобождения белков (ферментов), прочно связанных с биомембранами митохондрий или других субклеточных структур, применяются тритон Х-100 (С8Н17-(С6Н4)-0-(СН2-СНОН)10Н), додецилсульфат натрия (СН3-(СН2)10-СН2-О-S03Na) и дезоксихолат натрия. Следует, однако, иметь в виду, что детергенты, вызывая разрыв белково-белковых связей, разрушают олигомерную (четвертичную) структуру белков.

• Фракционировании белков (разделении смеси белков) - проводится после достижения полной экстракции белков, т. е. перевода белков в растворенное состояние [показать]

  Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. По химическим и физическим свойствам вода, входящая в состав гидратной оболочки, отличается от чистого растворителя. В частности, температура замерзания ее составляет - 40 °С. В этой воде хуже растворяются сахара, соли и другие вещества. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдается дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок.

  Белковые вещества весьма чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов (органических растворителей, кислот, щелочей), поэтому обычные методы органической химии, применяемые для изолирования того или иного вещества из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, кристаллизация и др.), в данном случае неприемлемы. Белки в этих условиях теряют некоторые весьма существенные природные (нативные) свойства, в частности растворимость, биологическую активность, подвергаясь денатурации. Были разработаны эффективные методы выделения белков в мягких условиях, при низкой температуре (не более 4 °С), с применением щадящих нативную структуру химических реагентов.

  Методы разделения смеси белков:

  • Высаливание [показать]

    При добавлении солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гель-хроматографии.

    Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения балластных белков или выделения исследуемого фермента. Поскольку различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония, этот метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении).

    На величину высаливания белков оказывает влияние не только природа и концентрация соли, но и рН среды и температура. Считается, что главную роль при этом играет валентность ионов. Действие разных ионов принято сравнивать не по молярной концентрации соли, а по так называемой ионной силе (), которая равна половине суммы произведений концентрации каждого иона (с) на квадрат его валентности (V):

    Более тонкое разделение белков плазмы крови человека на фракции достигается при применении различных концентраций этанола при низкой (от -3 до - 5°С) температуре по методу Кона. В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. Указанным методом часто пользуются для получения отдельных фракций крови, используемых в качестве кровезаменителей. На рис. 1 представлена диаграмма фракционирования белков плазмы крови человека.

  • Хроматография [показать]

    Принцип метода хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, был достойно оценен мировой научной общественностью, по поводу чего швейцарский ученый П. Каррер писал в 1948 г.: "Никакое другое открытие не оказало такого огромного влияния и так не расширило возможности исследования химика-органика, как хроматографический анализ Цвета. Исследования в области витаминов и гормонов, каротиноидов и многочисленных других природных соединений никогда не могли бы развиться так быстро и дать такие большие результаты, если бы они не были основаны на новом методе, который, вместе с тем, позволил установить факт наличия в природе разнообразия родственных соединений".

    Принцип основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке. Вследствие этого происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента.

    Дальнейшая работа заключается в применении подходящих элюентов, которые при пропускании через колонку, ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества, последовательно собираемые в коллекторе фракций (принцип сорбции - десорбции).

    Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из смеси оказался метод колоночной хроматографии с гидроксиапатитом, различными ионообменными смолами и производными целлюлозы в качестве носителей. Хроматография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов.

    • Адсорбционная хроматография [показать]

      Адсорбционная хроматография

      Разделение компонентов смеси (образца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в стеклянную вертикальную трубку (колонку) и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку, и компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте. Затем приступают к стадии освобождения (десорбции) компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты.

      На рис. 2 показано разделение двух разных веществ (А и В), перемещающихся по колонке с разной скоростью.

      Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

    • Распределительная хроматография [показать]

      Распределительная хроматография

      В отличие от адсорбционной твердая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы. Распределительная хроматография, как и адсорбционная, может осуществляться на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель. Образец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку; разделяемые вещества, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органического растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки. Собранные при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно вещество, объединяют вместе для выделения этого вещества в чистом виде.

      Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других веществ. В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги.

      На рис. 3 представлена схема, иллюстрирующая восходящую и нисходящую распределительную хроматографию на бумаге.

      Образец помещается на одном конце бумажной полосы, и этим же концом бумагу погружают в подходящую смесь органических растворителей (например, бутанол - уксусная кислота - вода в определенных соотношениях). При движении растворителя в силу капиллярности по бумаге происходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушивают и местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами.

    • Ионообменная хроматография [показать]

      Ионообменная хроматография

      Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно заряженные анионо-обменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы.

      Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производные полистирола и целлюлозы, несущие следующие функциональные группы:

      Аналогичные функциональные группы содержат триэтиламиноэтил (ТЭАЭ)- и аминоэтил (АЭ)-целлюлозы.

      Катионообменники представлены сульфированными полистиролами и карбоксиметилцеллюлозой, имеющими следующие функциональные группы:

      В зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается часть белков и задерживается на колонке, в то время как другие беспрепятственно выходят с колонки. "Осажденные" на колонке белки снимают с колонки, применяя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.

      Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), широко используются в фармакологии (при создании и определении лекарственных веществ), в клинической биохимии (при определении биологически активных веществ в физиологических жидкостях), в биотехнологических процессах и производствах и других областях; они позволяют определять вещества в нано-, пико- и фемтаграммных количествах.

    • Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) [показать]

      Аффинная хроматография

      Основана на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами - лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. При этом благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носителем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами.

      Несомненным достоинством этого метода является возможность одноэтапно выделить заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты. При помощи аффинной хроматографии, например, удалось сравнительно легко выделить очищенные препараты аминоацил-тРНК-синтетаз на полиакрилгидразидагаровом геле, к которому в качестве лигандов были присоединены определенные тРНК (транспортные РНК).

    • Гель-хроматография [показать]

      Гель-хроматография

      В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида декстрана (Декстран является полисахаридом, синтезируемым микроорганизмами) образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку.

      Разделение веществ этим методом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки; небольшие молекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью движутся вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой:

      V = V0 + K x Vi,

      
      где где V-объем элюирующей жидкости вещества с данным К, мл; V0 - свободный объем колонки или общий объем внешнего растворителя (вне зерен геля), мл; Vi - объем растворителя внутри геля, мл; К - коэффициент распределения для растворенного вещества между растворителем внутри зерен геля и окружающим растворителем.

      Если анализируемую пробу, содержащую одно растворенное вещество с К=1 и второе с К=О, внести в колонку с сефадексом, то второе вещество появится в элюирующей жидкости сразу же после выхода из колонки V0, а первое - только после выхода объема V0 + Vi.

      Поскольку белки, обладающие большой молекулярной массой и размерами молекулы, не диффундируют внутрь зерен сефадекса, они первыми вымываются из колонки после выхода свободного объема колонки V0, в то время как все остальные вещества (включая низкомолекулярные примеси) вымываются после выхода объема, равного V0 + К x Vi.

      Метод нашел широкое применение в препаративной энзимологии. С помощью сефадекса можно разделить белки с разной молекулярной массой.

      ________________________
      Сефадекс - коммерческий препарат, свое название получил от начальных слогов трех слов: separation (разделение), Pharmacia (наименование фармацевтической фирмы в Швеции), dextran (декстран). Наряду с сефадексом используют для целей разделения белков и других биомолекул также сефарозу, сефакрил, биогели, молселект, акрилекс и др.

  • Электрофорез [показать]

    Электрофорез

    Метод свободного электрофореза, детально разработанный лауреатом Нобелевской премии А. Тизелиусом, основан на различии в скорости движения белков (подвижности белков) в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора.

    В последнее время более широкое распространение получили методы зонального электрофореза белков на различных носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе. Преимущества их по сравнению с методом свободного электрофореза в том, что исключается размывание границы белок - растворитель в результате диффузии и конвекции, не требуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения границы, а для анализа необходимо небольшое количество белка (подробно эти методы и соответствующая аппаратура рассматриваются в практических руководствах по биохимии).

    Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. discontinuous - прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями рН и различной степени пористости гель. Следует указать на высокую разрешающую способность диск-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле - 10, а в полиакриламидном геле - до 18 разных белковых фракций.

    Для выявления белков при электрофорезе в гелях их обрабатывают одним из следующих красителей: бромфеноловым синим, амидо черным 10 В, кислотным синим 83, кумасси бриллиантовым голубым R-250 и др. Интенсивность окраски и соответственно относительное содержание каждой белковой фракции обычно определяют денситометрически путем прямого сканирования на денситометре. В последние годы стали применять методы электрофореза белков с градиентом концентрации геля, что значительно повышает разрешающую способность, в особенности при фракционировании белков с высокой молекулярной массой, превышающей 50000-100000 Да.

    Весьма перспективными методами разделения белков (как и определения ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты метода изоэлектрического фокусирования, изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах (на колонке или в тонком слое) с градиентом рН. При этом точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т. е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении рН равен нулю.

    При работе методом изоэлектрического фокусирования применяют смеси синтетических полиаминополикарбоновых кислот (амфолины) для создания градиента рН в диапазоне от 3,0 до 10,0.

• Очистке белков (выделению) и получению индивидуального белка [показать]

  Очистка белков от низкомолекулярных примесей

  Применение в определенной последовательности ряда из перечисленных выше методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей.

  Для полного освобождения белков от низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы диализа, гель-хроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. При диализе используются полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

  Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических белков (первый кристаллический фермент (уреаза) был получен Д. Самнером в 1926 г.). Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.

  Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекулярных примесей дают гель-хроматография и ультрафильтрация. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.

Выбор методов выделения и очистки белка основывается на его свойствах. (см. табл. 1 [показать])

Таблица 1. Примерная схема выделения и очистки белкаОбъект исследования Признак, используемый для выделения и очистки белка Приемы и методы Цель операции и ее эффективностьОрган, ткань, клетка, гомогенат, органоиды Локализация белка во внутри- или внеклеточных структурах (структурный признак) Обработка веществами, разделяющими межклеточные контакты (ферменты, комплексоны кальция). Механическое измельчение (гомогенизация), дифференциальное центрифугирование (разделение в центробежном поле) Целевая подготовка биологического материала для извлечения нужного белка, что позволяет повысить эффективность выделения путем отбора материала с наибольшим содержанием белка (вне клетки он распределен равномерно, внутри клетки локализован преимущественно в одном из органоидов)То же Растворимость в воде, органических жидкостях, солевых растворах Экстракция Извлечение фракции биологического материала, содержащей интересующий белок. При этом частично происходит очистка выделяемого белка от других плохо экстрагируемых белковСуммарные белки экстракта Различия в размерах гидратных оболочек и зарядах белковВысаливаниеГрубая очистка белка, позволяющая освободиться от основной массы сопутствующих (загрязняющих) белковРазличия в термостабильности белковТермофракционированиеРазличия в изоэлектрической точке белковКислотно-щелочная обработка (фракционирование)Частично очищенные белки Неспособность проходить через полупроницаемые мембраны (высокая молекулярная масса) Диализ (электродиализ), ультрафильтрация Освобождение от низкомолекулярных биологических примесей и веществ, использованных при грубой очистке (солей, кислот, щелочей, органических жидкостей), что необходимо для эффективной последующей очистки белкаНеспособность проходить через поры (сетку) гранулированного геля Фильтрация через мелкопористые гранулированные гелиЧастично очищенные белки, освобожденные от низко молекулярных примесей Различия в кислотно-основных свойствах белковИонообменная хроматография Получение гомогенного белкаРазличия в сродстве белков к неполярному адсорбентуАдсорбционная хроматографияРазличия в молекулярной массе белковГельхроматография (проникающая хроматография)Специфичность связывания белков с лигандамиАффинная (лигандная) хроматографияРазличия в знаке и величине заряда белковЭлектрофорез в разных поддерживающих средах (гели крахмала, агара, полиакриламида, ацетaта целлюлозы, декстрана и т.д.)Различия в изоэлектрических точках белковИзоэлектрическое фокусирование в градиенте рНРазличия в знаке, величине заряда и в молекулярной массе белковИзотахофорез

Определение гомогенности белков

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если белок движется при диск-электрофорезе в виде одной узкой полосы и если в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая и т. д.), то эти данные с большой долей вероятности могут свидетельствовать об однородности исследуемого белка. Для строгого доказательства гомогенности белка требуется одновременное использование нескольких методов.

В основе иммунохимического метода контроля гомогенности исследуемого белка лежит реакция преципитации его с соответствующей антисывороткой, полученной от иммунизированных этим белком животных.

Не потерял своего значения и метод определения растворимости белка. Этот метод, предложенный еще Д. Нортропом (и лаборатории Нортропа в 1930-1931 гг. впервые получены в химически индивидуальном и кристаллическом состоянии пепсин, химотрипсин и трипсин), основан на правиле фаз Гиббса, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от количества вещества, находящегося в твердой фазе. Метод может быть выполнен сравнительно легко и быстро в микромасштабах. Обычно определяют растворимость увеличивающегося количества исследуемого белка при постоянном количестве растворителя.

Методы изучения структуры белка. После выделения гомогенного белка исследуют его структурную организацию (первичную, вторичную, третичную и четвертичную). Основные методы и приемы, используемые для изучения структуры белков, перечислены в табл. 2. Как правило, для получения возможно более полной информации о высших уровнях структурной организации белков используют несколько разных методов.

Таблица 2. Некоторые методы изучения разных уровней структурной организации белкаСтруктура белка Метод изучения Цель методаПервичная Гидролиз (кислотный, щелочной, ферментативный)

Ионообменная хроматография на анализаторе аминокислот

Сиквенация (на приборах сиквенаторах)

Разрыв пептидных связей и получение смеси аминокислот

Определение аминокислотного состава путем разделения аминокислот, основанного на различиях в их кислотно-основных свойствах

Установление порядка чередования аминокислот путем автоматического последовательного отсечения аминокислот от полипептидной цепи и их идентификации

Вторичная Спектрополяриметрия (измерение угла вращения плоскополяризованного света на спектрополяриметрах) Обнаружение регулярных структур -спиралей и -структур. Метод основан на способности аминокислотных остатков полипептидной цепи вращать плоскость поляризованного света влево. Находясь в виде беспорядочного клубка, белок вращает плоскость тоже влево. -Спирали и -структуры вращают плоскость поляризации света вправо. Чем больше степень регулярных структур (- и -структур) в белке, тем больше выражено правое, вращениеМетод изотопного обмена Установление степени спирализaции белка (количества -спиралей). Метод основан на определении медленно обменивающегося водорода иминных групп пептидных связей на дейтерий тяжелой воды (D2О). Медленно обменивается водород пептидных связей в том случае, если он участвует в образовании межпептидных водородных связей. Чем больше медленно обменивающегося водорода белка, тем выше степень спирализацииУФ спектрофотометрия (измерение степени поглощения белков при 190 нм на спектрофотометрах) Определение степени спирализации белков (количества -спиралей). Метод основан на гипохромном эффекте, т. е. пониженном поглощении света при 190 нм белком, находящимся в спирализованном состоянии, но сравнению с аморфным (беспорядочный клубок). (При 190 нм максимум поглощения пептидных групп.) По наличию гипохромного эффекта можно судить о степени спирализации белка: чем он выраженнее, тем выше спирализацияИК спектроскопия (измерение спектра поглощения белков в инфракрасной области на инфракрасных спектрофотометрах) Установление наличия регулярных структур в белке по ориентации относительно оси макромолекулы групп -NН- и С=О пептидных связей. Метод основан на измерении разности поглощения ИК света, поляризованного вдоль и перпендикулярно оси ориентации молекулы белкаТретичная Электронная микроскопия Определение конфигурации белков и отдельных частей их молекул, например спиральных участков. Для повышения контрастности (электронной плотности) белков используют специальные покрытия, которые адсорбируются поверхностью белка. При облучении таких белков пучком электронов происходит их поглощение контрастирующими веществами (на пленке они темные), которые окружают белок и его структуры (на пленке они светлые)Рентгеноструктурный анализ Установление пространственного расположения всех атомов в молекуле белка. Метод основан на дифракции рентгеновского излучения электронами, окружающими ядра атомов в кристалле белка, поскольку длина волны рентгеновского излучения соизмерима с межатомными расстояниями в кристалле белка. На фотопластинке, помещенной за кристаллом, рентгеновское излучение дает дифракционную картину, характерную для третичной структуры белкаЧетвертичная Электронная микроскопияТо же, что и для установления третичной структурыРентгеноструктурный анализТо жеЭлектрофорез Установление наличия разных субъединиц в олигомере. Принцип основан на неодинаковой подвижности в электрическом поле олигомеров, состоящих из разных субъединиц, каждая из которых имеет свой заряд

Искусственный синтез белка. Очень трудоемкий процесс искусственного синтеза белка в настоящее время автоматизирован. Искусственный синтез позволяет получать белки, абсолютно идентичные белкам человека и не являющиеся чужеродными в отличие от аналогичных белков, выделенных из органов животных. При этом сохраняется дорогое природное сырье - тушки и органы животных. В настоящее время синтезированы короткие пептиды (окситоцин, вазопрессин, пептиды гипоталамуса) некоторые тропные белковые гормоны гипофиза - кортикотропин, соматотропин, инсулин и т. д., которые могут применяться как лекарственные средства. Выпуск некоторых из них осуществляется в промышленных масштабах.

Страница 1 2 3 4 5 6 7 всего страниц: 7